ÿþ<HTML><HEAD><TITLE>35º Conbravet - Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária</TITLE><link rel=STYLESHEET type=text/css href=css.css></HEAD><BODY aLink=#ff0000 bgColor=#FFFFFF leftMargin=0 link=#000000 text=#000000 topMargin=0 vLink=#000000 marginheight=0 marginwidth=0><table align=center width=700 cellpadding=0 cellspacing=0><tr><td align=left bgcolor=#cccccc valign=top width=550><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=3><font size=1>35º Conbravet - Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária</font></font></strong><font face=Verdana size=1><b><br></b></font><font face=Verdana, Arial,Helvetica, sans-serif size=1><strong> </strong></font></font></td><td align=right bgcolor=#cccccc valign=top width=150><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=1><font size=1>ResumoID:12.753-2</font></em></font></strong></font></td></tr><tr><td colspan=2><br><br><table align=center width=700><tr><td>AREA: <b>Biotecnologia</b><p align=justify><strong>CLONAGEM E EXPRESSÂO DA GLICOPROTEÍNA DO VÍRUS RÁBICO EM PICHIA PASTORIS </strong></p><p align=justify><b>Lorena Leonardo Souza </b> (<i>UFPel</i>); <b>Alceu dos Santos Gonçalves Junior </b> (<i>UFPel</i>); <b><u>Carina Martins de Moraes </u></b> (<i>UFPel</i>); <b>Fábio Pereira Leivas Leite </b> (<i>UFPel</i>); <b>Carlos Gil Turnes </b> (<i>UFPel</i>)<br><br></p><b><font size=2>Resumo</font></b><p align=justify class=tres><font size=2>A raiva é uma doença infecciosa que acomete o homem e todos os animais de sangue quente. É uma zoonose transmitida pela inoculação do vírus rábico, contido na saliva do animal infectado, principalmente pela mordedura. O vírus da raiva é um vírus RNA, fita simples pertencente à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae, Gênero Lyssavirus. Seu genoma está composto por cinco genes, os quais codificam para nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), proteína da matriz (M), glicoproteína (G) e para uma RNA polimerase. A glicoproteína é o principal antígeno capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes e de conferir imunidade protetora contra raiva. O sistema de expressão Pichia pastoris tem obtido importante aceitação como organismo hospedeiro para produção de proteínas exógenas. O presente trabalho descreve a P. pastoris como um sistema de expressão da glicoproteína do vírus rábico como uma alternativa à produção de antígenos vacinais. Primers específicos para o gene da glicoproteína do vírus rábico cepa ERA foram desenhados a partir de seqüências depositadas no GeneBank. A amplificação da glicoproteína foi realizada em uma reação de PCR e os produtos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 0,8&#61477; e posteriormente purificados. O produto do PCR e o vetor pPICZalfab foram digeridos com as enzimas de restrição Kpn I e EcoR I e o material digerido foi purificado com Kit GFX. Após ligação dos fragmentos, os mesmos foram transformados em E. coli Top10F e semeados em placas contendo meio LB e zeocina. As colônias de bactérias contendo o inserto de interesse foram crescidas em meio líquido LB contendo zeocina mantidas a 37°C, sob agitação, por uma noite e após tiveram seus plasmídeos extraídos por lise alcalina com o Kit GFXTM Micro Plasmid Prep. Os plasmídeos recombinantes foram linearizados com a enzima PmeI para permitir a recombinação com o a levedura Pichia pastoris. Para análise dos clones, colônias recombinantes foram repicadas em YPD líquido e incubadas a 280C overnight sob agitação constante. No dia seguinte os cultivos foram centrifugados e o sobrenadante descartado. O pellet foi ressuspendido em BMMY incubado a 280C overnight sob agitação constante, para que as células recombinantes iniciassem a expressão de proteínas. Durante seis dias, periodicamente coletou-se 80 µl de sobrenadante e adicionou-se 100 µl de metanol. As amostras coletadas foram analisadas quanto ao nível de expressão de proteínas por Dot Immunobinding Assay e Western Blot com MAb anti-histidina conjugado à peroxidase e anticorpo anti-rábico para confirmar a expressão da glicoproteína. A expressão da glicoproteína foi confirmada pelas técnicas de Dot Immunobinding Assay e Western Blot, onde a glicoproteína reagiu especificamente com anticorpo monoclonal anti-histidina. A proteína demonstrou ser antigênica ao ser reconhecida por anticorpos anti-rábicos proveniente de animais experimentalmente infectados com o vírus rábico. Este resultado permite concluir que a P. pastoris é capaz de expressar a glicoproteína do vírus da raiva com características antigênicas sugerindo que a expressão de antígeno rábico em P. pastoris é uma alternativa viável para a produção de imunógeno. </font></p></td></tr></table></tr></td></table></body></html>