ÿþ<HTML><HEAD><TITLE>35º Conbravet - Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária</TITLE><link rel=STYLESHEET type=text/css href=css.css></HEAD><BODY aLink=#ff0000 bgColor=#FFFFFF leftMargin=0 link=#000000 text=#000000 topMargin=0 vLink=#000000 marginheight=0 marginwidth=0><table align=center width=700 cellpadding=0 cellspacing=0><tr><td align=left bgcolor=#cccccc valign=top width=550><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=3><font size=1>35º Conbravet - Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária</font></font></strong><font face=Verdana size=1><b><br></b></font><font face=Verdana, Arial,Helvetica, sans-serif size=1><strong> </strong></font></font></td><td align=right bgcolor=#cccccc valign=top width=150><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=1><font size=1>ResumoID:12.722-1</font></em></font></strong></font></td></tr><tr><td colspan=2><br><br><table align=center width=700><tr><td>AREA: <b>Biotecnologia</b><p align=justify><strong>UTILIZAÇÃO DE PCR MULTIPLEX PARA O DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO DA MASTITE BOVINA</strong></p><p align=justify><b>Marisa Araújo Silva </b> (<i>Escola de Veterinária da UFMG</i>); <b>Geraldo Márcio da Costa </b> (<i>Universidade Federal de Lavras</i>); <b><u>Nivaldo da Silva </u></b> (<i>Escola de Veterinária da UFMG</i>)<br><br></p><b><font size=2>Resumo</font></b><p align=justify class=tres><font size=2>Introdução Mastite é a doença infecciosa que mais afeta as vacas leiteiras e a responsável pelas maiores perdas econômicas do setor leiteiro. Inúmeros são os agentes etiológicos envolvidos nos processos infecciosos da glândula mamária. Este trabalho teve como objetivo, validar uma PCR Multiplex como teste diagnóstico capaz de detectar genes os S. aureus, S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. aureus resistente a meticilina (MRSA) diretamente a partir de amostras de leite de vacas com mastite, permitindo monitorar a eficiência dos programas de controle e qualidade do leite. Metodologia 1- Obtenção do DNA genômico a partir do leite artificialmente contaminado: Amostras padrão foram cultivadas individualmente em caldo BHI e incubadas a 37ºC, por 24 horas. 1 mL de cada caldo foi inoculado em 10 mL de leite UHT individualmente, posteriormente foram realizadas diluições seriadas em leite. Cada diluição foi plaqueada em ágar Plate Count, para se conhecer a quantidade de UFC/mL e assim avaliar a sensibilidade do teste. Transferiu-se 1,8 mL das diluições em leite artificialmente contaminados em microtubos e adicionou-se 200 µL de tampão NET (50 mM NaCl, 125 mM EDTA, 50mM Tris-HCl  pH 7,6). Após um minuto, a solução foi centrifugada e o pellet submetido ao processo de extração de DNA descrito por Millar et al. (2000). O DNA extraído foi purificado pelo método Fenol-Clorofórmio (Silva e Silva, 2005). As PCRs foram realizadas com primers que amplificam a região espécie-específica 16-23S do rRNA de S. aureus (1300, 900, 420 e 200pb), S. agalactiae (270pb), S. dysgalactiae (264pb) e S. uberis (330pb) e para detecção de MRSA empregou-se primers que amplificam o gene MecA (533pb). A especificidade da técnica foi verificada utilizando de outras bactérias S. bovis e S. epidermidis e S. intermedius. 2- Obtenção do DNA genômico a partir do leite de tanque de expansão Testou-se 30 amostras de leite de tanque de expansão enviadas ao Laboratório de Análise da Qualidade do Leite  LabUFMG  MAPA. As amostras possuíam contagem bacteriana acima de 1000 UFC/mL e continham azidiol (substância bacteriostática). Resultados e discussão Os primers foram específicos para os microrganismos pesquisados. O limite de detecção foi de 1000 UFC/mL. Todas as espécies foram detectadas a partir do leite de tanque de expansão, chama-se a atenção para a detecção de MRSA, que é o primeiro registro no Brasil a partir de leite bovino e que constitui um risco a saúde pública. A técnica foi sensível e especifica para detecção de S. aureus, S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e MRSA diretamente a partir de leite infectado, podendo ser utilizada para diagnóstico de mastite. Referências Bibliográficas MILLAR, B. C.; JIRU, X.; MOORE, J. E. et al. A simple and sensitive method to extract bacterial, yeast and fungal DNA from blood culture material J. Microbiol. Methods,v. 42, p. 139-147, 2000 SILVA, E. R.; SILVA, N. Coagulase gene typing of Staphylococcus aureus isolated from cows with mastitis in southeastern Brazil Can. J. Vet. Res., v. 69, n. 4, p. 260-264, 2005 </font></p></td></tr></table></tr></td></table></body></html>