35º Conbravet - Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária

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ResumoID:12.491-1

AREA: Biotecnologia

RT-PCR PARA IDENTIFICAÇÃO DO VÍRUS DA CINOMOSE CANINA

Clarissa Fonseca Caetano (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Paula Fonseca Finger (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Bianca Sica Siedler (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Lívia Silveira Munhoz (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Camila Oliveira Vilela (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Lilian das Neves Ferreira (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Geferson Fischer (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Gilberto D'avila Vargas (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Telmo Vidor (Universidade Federal de Pelotas - UFPel); Silvia Oliveira Hübner (Universidade Federal de Pelotas - UFPel)

Resumo

Descreve-se a técnica por RT-PCR para identificação do vírus da cinomose canina em treze amostras de animais suspeitos, uma amostra para o controle positivo para CDV que foi amplificada em células MDCK, uma amostra para o controle negativo (adicionado água ultra pura em vez do cDNA). O processo iniciou-se pela extração de RNA que foi realizada com Trizol, de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). A segunda etapa realizada foi a síntese de cDNA utilizando-se 5 µg do RNA total, em uma reação de 25 µl que conteve ainda 150 ng de “random” primers (Invitrogen), 1 µl de desoxinucleosideos trifosfatados (dNTP’s – 10 mM), tampão de síntese (New England Biolabs), 0.1 M DDT, 40 U de RNaseOUT (Invitrogen) e 40 U de Transcriptase reversa M-MuLV (New England Biolabs), segundo a metodologia descrita (Ulett 2000). A técnica do PCR conteve 2 µl de cDNA, 0,25 µl de dNTP (20 mM), tampão - PCR 1 X, 3 mM de MgCl2, 0,3µl de Taq DNA polimerase (1,5 U), e água ultra pura autoclavada para o volume de 25 μl. Os primers utilizados foram descritos no trabalho de Maes et al (2003) e sintetizados para amplificação de um segmento do gene que codifica a nucleoproteína P do CDV (gene P). O primer “forward” foi 5’ AAG AGG TTA AGG GAA TCG 3’, e o primer “reverse” 5’ GAG AAA AGC TCA TCA TCG 3’, resultando num produto de 585 pares de bases (bp). Os produtos amplificados pela PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão TBE 1X (Tris-Borato 90 mM, EDTA 2 Mm; pH 8,4), sob voltagem constante (180V) por aproximadamente 60 minutos. O gel foi corado em solução contendo 0,3 μl de brometo de etídeo e visualizado sob luz ultravioleta. Foi obtido amplificação da seqüência do gene P do CDV do tamanho esperado através da técnica de RT-PCR para oito das treze amostras testadas. Constatou-se que RT-PCR é um método molecular de diagnóstico com alta sensibilidade e especificidade.

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