35º Conbravet - Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária

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ResumoID:04.335-1

AREA: Microbiologia

DETECÇÃO DE HAEMOPHILUS SOMNUS EM SÊMEN BOVINO CONTAMINADO EXPERIMENTALMENTE PELA TÉCNICA DE PCR FLUORESCENTE

Francisca Elda Ferreira Dias (UFT); Caris Maroni Nunes (UNESP); Tania Vasconcelos Cavalcante (UFT); Hébelys Ibiapina Trindade (UFT); Katyane de Sousa Almeida (UFT); José Rafael Modulo (UNESP); José Fernando Garcia (UNESP)

Resumo

O objetivo deste estudo é avaliar a sensibilidade e especificidade do PCR fluorescente para diagnóstico de Haemophilus somnus em sêmen bovino. Doses inseminantes livres de patógenos foram contaminadas experimentalmente com H. somnus, diluídas em escalas de 100 à 106 bactérias/ml e submetidas à extração de DNA pelo método de fenol/clorofórmio e amplificados por PCR. Os microtubos contendo o DNA foram submetidos a 35 ciclos de amplificação, precedidos por desnaturação inicial a 94ºC por 5minutos. Os ciclos consistiram de desnaturação a 94ºC por 60segundos, hibridização dos oligonucleotídeos iniciadores a 55ºC por 60 segundos e extensão a 72ºC por 60segundos, ao final de 35 ciclos, os tubos foram mantidos a 72ºC por 10minutos. Os produtos da amplificação do DNA foram separados por eletroforese em gel de acrilamida 8% e separação eletroforética por sistema capilar em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA ABI-PRISM 310. Através dos oligonucleotídeos iniciadores HF e HR conseguiu-se a amplificação de um fragmento de 400 pares de bases a partir do DNA da bactéria H. somnus. Pela eletroforese em gel de poliacrilamida observa-se sinal positivo até aproximadamente 103bactérias/mL a partir das concentrações iniciais das soluções estoque já na análise por eletroforese capilar revelou positividade até a diluição de 10-3 bactérias/mL a partir das concentrações iniciais das soluções estoque de Haemophilus. A técnica de PCR mostrou-se uma valiosa ferramenta na detecção de H. somnus por permitir rapidez e sensibilidade, vantagens estas que poderão no futuro ser adicionadas aos métodos convencionais de detecção de patógenos no sêmen bovino.਍ഀ Palavras-chave: Bovino; Sêmen; Diagnóstico; PCR.਍ഀ

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